然而，命运却对这位巾帼英雄格外苛刻。万历四十一年（1613年），马千乘因不愿迎合太监邱乘云的索贿，被其诬告谋反，打入云阳监狱。狱中条件恶劣，马千乘本就征战多年，身体留有旧伤，竟在狱中一病不起，最终含冤而逝。彼时，他们的儿子马祥麟年仅十岁，无法承袭土司之职。为了守住马氏家族的基业，为了不让麾下三千白杆兵溃散，秦良玉强忍丧夫之痛，以女子之身，正式代领石柱宣抚使一职，成为大明历史上少有的女土司。
掌权后的秦良玉，并未因悲痛而消沉。她严格治军，号令严明，将白杆兵训练得更加精锐。同时，她轻徭薄赋，安抚百姓，石柱在她的治理下，呈现出一片安定祥和的景象，与周边战乱频发的地区形成鲜明对比。
泰昌元年（1620年），后金（清朝前身）大举入侵辽东，明军节节败退，朝廷急诏各地土司出兵援助。秦良玉接到诏令后，毫不犹豫地派兄长秦邦屏、弟弟秦民屏率领五千白杆兵先行出征。朝廷为表彰她的忠义，赐其三品官员服饰，并任命秦邦屏为都司佥书，秦民屏为守备。
天启元年（1621年），后金大军包围辽东重镇沈阳，秦邦屏、秦民屏随总兵童仲揆渡浑河，与后金兵展开血战。白杆兵虽装备简陋，却个个奋勇争先，用手中的白杆枪与后金的铁骑展开殊死搏斗，斩获敌首数千级，让不可一世的后金兵第一次尝到了惨败的滋味。可后金兵人数众多，且装备精良，白杆兵渐渐陷入重围。秦邦屏身中数十箭，依旧手持长枪，斩杀数名敌兵后，力竭战死；秦民屏身负重伤，拼死才突围而出。
浑河血战的消息传到石柱，秦良玉悲痛欲绝，却并未被击垮。她亲自率领三千白杆兵，星夜兼程，直奔榆关（今河北省山海关）。行军途中，她严令士兵不得扰民，所到之处，秋毫无犯，百姓们夹道相送，纷纷称赞她的治军严明。明熹宗朱由校得知后，深受感动，下诏给秦良玉加二品官员服饰，并封她为诰命夫人，封其子马祥麟为指挥使。
秦良玉并未满足于朝廷的封赏，她深知兄长战死沙场，身后事需妥善安置。于是，她上书朝廷，详细陈述秦邦屏的死